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Ancell抗CD64（FcRI）F（ab'）2用于阻斷調理血小板的吞噬作用
本研究著眼于抗血小板抗體糖基化對輸血患者巨噬細胞介導的吞噬清除能力的影響。抗CD64單克隆抗體的F（ab'）2用作體外吞噬阻斷對照。
“單核細胞來源的巨噬細胞用不同糖基化的抗HLA hIgG1調理的血小板的吞噬作用”Thijs L，Gesture Vidarsson等。
單核細胞來源巨噬細胞用不同糖基化的抗HLA hIgG1調理的血小板的吞噬作用
免疫介導的血小板難治性 （PR） 仍然是血小板輸注情況下的一個重大問題，主要由針對 I 類人白細胞抗原 （HLA） 的同種異體抗體的存在引起。用這些同種抗體調理供體血小板可通過多種機制（包括抗體依賴性細胞吞噬作用 （ADCP））在輸血后快速清除。有趣的是，并非所有同種異體免疫患者都會對不匹配的血小板輸注產生PR，這表明患者之間HLA特異性IgG反應存在差異。以前，我們觀察到抗HLA抗體的糖基化譜在PR患者之間差異很大，特別是在Fc半乳糖基化，唾液酸化和巖藻糖基化方面。在目前的研究中， 我們研究了不同Fc糖基化模式對單核細胞來源的人巨噬細胞吞噬調理血小板的影響，已知對補體沉積和FcγR結合的影響。我們發現，單核細胞來源的M1巨噬細胞對抗體和補體調理的血小板的吞噬作用不受這些定性IgG-聚糖差異的影響。
血小板輸注是一種經常給藥的治療方法，可降低血小板減少癥患者的死亡率和出血性并發癥。血小板輸注的一個主要問題是血小板難治性（PR），這是指多次血小板輸注后血小板計數增加不足。PR 的發病率范圍為 5%-15%，因患者特征和血小板制品制備而異 [報價單1–4].在大約 20% 的 PR 病例中，血小板清除是免疫介導的，主要是由針對 I 類人白細胞抗原 （HLA） 的同種抗體的存在引起，偶爾還有人血小板抗原 （HPA） [報價單5–9].用這些同種抗體調理供體血小板可在輸血后不久通過抗體依賴性細胞毒性 （ADCC）、補體依賴性細胞毒性 （CDC） 和/或抗體依賴性細胞吞噬作用 （ADCP） 導致清除 [報價單10–16].目前對于大量輸血的同種異體免疫患者，目前的主要管理策略是廣泛匹配血小板輸注產品，以防止 PR 和隨后的更差臨床結局 [報價單7–9].有趣的是，并非所有同種異體免疫患者都會因血小板輸注不匹配而發生 PR [報價單17,報價單18]，提示患者之間HLA特異性IgG反應的定性特征差異。
所有 IgG 分子都含有保守的 N-位于Fc區位置297的連接聚糖，影響抗體的結構和功能。該聚糖由 N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和甘露糖殘基，可以通過巖藻糖，平分GlcNAc和最多兩個半乳糖殘基拉長，兩者都可以被唾液酸殘基覆蓋。抗體Fc糖基化變化很大，之前在感染和同種異體免疫的情況下已經描述了改變的模式，已知這些改變會影響抗體效應功能，從而影響相關免疫應答的進展[報價單19–27].例如，巖藻糖殘基的缺失導致抗體與FcγRIIIa/b的結合親和力增加，這可能導致相關效應功能增加，例如ADCC和ADCP [報價單19–22,報價單25,報價單28,報價單29].此外，半乳糖基化與補體活化特別相關[報價單21,報價單24,報價單30,報價單31].我們和其他人最近表明，半乳糖基化通過增強的六聚化增加了抗體激活經典補體途徑的能力，這反過來又增加了補體沉積和CDC活性[報價單23,報價單30].唾液酸化略微增強補體活化，進一步增強[報價單21,報價單23,報價單32]，而平分GlcNAc對補體活化和FcγR結合均無影響[報價單21].
之前，我們表征了在接受血小板輸注的血液腫瘤患者中檢測到的抗HLA I類抗體的糖基化譜[報價單33]和被診斷為 PR 的患者 [報價單20].抗HLA IgG特異性糖基化譜在患者之間差異很大。對于大多數患者，我們觀察到與總IgG相比，HLA特異性IgG的Fc半乳糖基化和唾液酸化增加。此外，少數患者（35 名患者中有 2 名）也產生了巖藻糖基化水平極低的抗 HLA 抗體 [報價單33].
在同種異體免疫和 PR 的背景下，輸注的血小板主要被認為是在用抗 HLA 或 -HPA 同種抗體調理后被脾臟中的單核巨噬細胞清除 [報價單8,報價單10,報價單11,報價單13,報價單34,報價單35].存在幾種途徑，其中吞噬細胞可以通過非調理和調理受體檢測其吞噬作用靶標。非調理受體對于識別病原體相關分子模式（PAMP）和凋亡細胞至關重要，而調理受體識別用調理素靶向清除的細胞，例如IgG和補體成分。識別IgG的最重要和有效的吞噬受體是FcγRI（CD64），FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）和補體受體3（CR3或CD11b / CD18），用于識別iC3b和C3d [報價單36,報價單37].脾巨噬細胞具有高表達的CR3，FcγRI，FcγRII和FcγRIII[報價單14,報價單38–41].當血小板被IgG或補體成分調理時，血小板變得容易受到脾巨噬細胞表達的吞噬受體的結合，從而導致隨后的吞噬和破壞。血小板通過脾正弦的緩慢通過進一步增強了這一過程[報價單7,報價單11,報價單14].然而，補體系統受累以及血小板內在因素（如血小板凋亡和調理作用時活化）最近也被提出與 PR 中血小板存活率降低有關 [報價單12,報價單15,報價單35,報價單42–45].
有趣的是，對于抗體Fc糖基化對巨噬細胞使用不同糖基化的抗HLA同種抗體調理作用時血小板清除的影響知之甚少。特別是鑒于最近關于抗體Fc糖基化對FcγR結合和補體沉積的影響的發現，重要的是要更深入地了解抗體Fc糖基化對同種異體免疫時PR中涉及的清除機制的影響。在目前的研究中，我們研究了已知影響補體沉積和FcγR親和力的不同Fc糖基化模式對單核細胞來源的人巨噬細胞調理化血小板吞噬的影響。使用單核細胞來源的M1巨噬細胞，因為它們具有高表達水平的FcγR和CR3， 人脾巨噬細胞也高度表達。我們發現，通過改變Fc糖基化譜增加補體沉積和/或FcγRIIIa/b親和力并不影響人單核細胞來源的巨噬細胞對IgG調理化血小板的吞噬作用。 體外 型。
在書面知情同意后，從匿名Sanquin獻血者獲得的血沉棕黃層中分離出單核細胞。血小板是從匿名健康志愿者的檸檬全血中分離出來的，并得到知情的書面同意。單核細胞和血小板不是從同一個個體獲得的。所有程序均由Sanquin道德咨詢委員會批準，并符合赫爾辛基宣言和荷蘭法規。
本研究中使用的抗HLA單克隆抗體的生產和糖工程技術已被詳細描述[報價單46–52].簡而言之，所有抗HLA mAb可變區域的蛋白質序列用于組裝編碼全人IgG1和PG LA LA Fc突變體（P329 G，L234A和L235A）的pcDNA3.1表達載體，這些突變體不能結合補體和FcγR[報價單53].表達載體用于我們內部HEK Freestyle系統中重組抗體的生產。為了獲得具有某些所需聚糖譜的抗體，在轉染之前/期間使用化學抑制劑2-脫氧-2-氟-L-巖藻糖（2FF，碳合成物）來減少fc巖藻糖基化和5 mM D-半乳糖（Sigma Aldrich），并編碼酶β-1，4半乳糖基轉移酶1（B4GALT1）和β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸轉移酶1（ST6GALT1）的構建體，以增加半乳糖基化和唾液酸化。轉染后6天純化單克隆抗體，并進行液相色譜-質譜的IgG Fc糖基化分析[報價單46,報價單47,報價單54].
如前所述，通過IBIS M×96（IBIS技術）上的表面等離子體共振（SPR）評估抗體與人FcγR類別的結合[報價單55,報價單56].使用連續流動微量觀察儀（Wasatch Microfluidics）將所有C端生物素化的hFcγR點到單個SensEye G-鏈霉親和素傳感器（Ssens）上，該傳感器允許同時測量每種抗體與所有hFcγR的結合親和力。生物素化的hFcγR以三倍稀釋度點樣，hFcγRIIa-H131，hFcγRIIIa-F158，hFcγRIIIb-NA1和hFcγRIIIb-NA2從30 nM到1 nM，hFcγRIIa-R131和hFcγRIIb的稀釋范圍為10 nM至0.3 nM，在補充有0.075%吐溫-80（VWR，M126-100 ml），pH 7.4的PBS中，hFcγRIIIa-V158的范圍為100 nM至3 nM。每個樣品后用10nM Gly-HCl，pH 2.0進行再生。解離常數（KD）使用Rmax = 500的平衡擬合計算。 所有結合數據的分析和計算均使用洗滌器軟件版本2（生物軟件）和Excel完成。
使用CD14+磁性微珠分離（Miltenyi Biotec）從血沉棕黃層衍生的PBMC中分離單核細胞，隨后冷凍直至如前所述進一步使用[報價單44,報價單57].采用流式細胞術測定單核細胞純度，為>90%。單核細胞分化為單核細胞來源的巨噬細胞，如所述[報價單58].簡而言之，單核細胞在第0天解凍并在24孔培養板（0.25x106 每孔單核細胞）在 IMDM 1640（龍沙）中存在 10 ng/mL 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF、CellGenix），含有 10% 胎牛血清 （Bodinco） 100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 鏈霉素（均為 Gibco），CO 為 5% CO2 37°C. 細胞共培養9天，培養第3天加入新鮮培養基和GM-CSF。
通過離心枸櫞酸全血，從富血小板血漿（PRP）中分離出具有已知HLA分型的健康志愿者的血小板 g 20分鐘，使用前面描述的方法進行優化以避免血小板活化[報價單12,報價單16].此后，10 體積% ACD（酸性檸檬酸鹽葡萄糖，85 mM Na3-檸檬酸鹽·2 H2O， 71 mM檸檬酸·H2O和111mM D-葡萄糖）加入。PRP離心（850 g 8分鐘），并用洗滌緩沖液（WB;36mM檸檬酸·H2O，103 mM NaCl，5 mM KCl，5 mM EDTA，5.6 mM D-葡萄糖，pH 6.5）。將血小板濃度設置為6×108 PBS中的細胞/ mL，并在室溫下與3.75μM PKH26（西格瑪奧爾德里奇）在輥組上孵育20分鐘。加入10體積%FCS終止標記過程，用WB洗滌標記的血小板并重懸于PBS + 0.5%BSA中。5 × 106 將血小板與等體積的重組抗HLA抗體一起孵育，并在室溫下混合補體足夠的人血清30分鐘。對于某些條件，將血清在56°C下預孵育30分鐘以滅活補體。用PBS + 0.5%BSA + 5 mM EDTA洗滌血小板3次，并重懸于巨噬細胞培養基中。補體沉積（C3b）通過用抗補體C3b/iC3b-APC抗體克隆染色一小部分血小板來評估補體沉積（C3b）：3E7/C3b（1/250，生物傳奇）
對于吞噬作用測定，將調理的血小板在37°C下與同種異體巨噬細胞以1：40巨噬細胞：血小板比例孵育30分鐘。對于某些條件，將巨噬細胞在室溫下與10μg/ mL FcγR封閉抗體（抗CD16，抗CD32和/或抗CD64）和同種型對照預孵育30分鐘。抗CD64（克隆10.1，阻斷FcγRI）作為f（ab'）2片段從Ancell公司訂購，而抗CD32（克隆AT10，阻斷FcγRIIa/b/c），抗CD16（克隆3G8，阻斷FcγRIIIa/b）和同種型（抗生物素）被克隆并生產為hIgG1 N297A P329 G，L234A和L235A，使它們無法結合C1q和FcγRs [報價單53].此后，用PBS洗滌細胞并使用130mMli多卡因（Sigma Aldrich）和10mM EDTA（默克）收獲。收獲后，將巨噬細胞保持在冰上，并用冰冷的PBS + 0.5%牛血清白蛋白（BSA，Sigma Aldrich）+ 2 mM EDTA（默克）洗滌，隨后用冰冷的PBS洗滌。收獲后，將細胞用3.7%多聚甲醛（Sigma Aldrich）在PBS中固定在室溫下15分鐘。接下來，用PBS + 0.5%BSA洗滌細胞，并使用APC標記的抗HLA-DR（克隆L243，BD Biosciences）和BV421標記的抗CD42a（克隆ALMA.16，BD Biosciences）染色20分鐘在PBS + 0.5%BSA的室溫下。用PBS + 0.5%BSA洗滌細胞，并使用BD LSR II流式細胞儀和成像流式細胞術（ImageStreamX Mark II成像流式細胞術，默克密理博）進行分析。使用Flowjo v 10.8.1分析流式細胞術數據; 基于FSC / SSC，單細胞和HLA-DR+對細胞進行門控，之后對PKH26標記的血小板和抗CD42a-BV421（PKH26+ CD42a-：吞噬;PKH+ CD42a+：結合的血小板;補充圖S3A）。使用IDEAS v6軟件分析成像流式細胞術數據，涉及對門細胞的縱橫比強度/面積Ch01進行門控，隨后對焦點細胞（梯度RMS Ch01）和HLA-DR+細胞進行門控巨噬細胞，之后對PKH26標記的血小板和抗CD42a-BV421陽性細胞進行門控（補充圖S3B）。 使用IDEAS v6軟件分析成像流式細胞術數據，涉及對門細胞的縱橫比強度/面積Ch01進行門控，隨后對焦點細胞（梯度RMS Ch01）和HLA-DR+細胞進行門控巨噬細胞，之后對PKH26標記的血小板和抗CD42a-BV421陽性細胞進行門控（補充圖S3B）。 使用IDEAS v6軟件分析成像流式細胞術數據，涉及對門細胞的縱橫比強度/面積Ch01進行門控，隨后對焦點細胞（梯度RMS Ch01）和HLA-DR+細胞進行門控巨噬細胞，之后對PKH26標記的血小板和抗CD42a-BV421陽性細胞進行門控（補充圖S3B）。
統計分析在Windows版GraphPad Prism 8.02（263）中執行。使用普通單因素方差分析和鄧尼特多重比較檢驗分析條形圖。重要性水平設定為 p ≤ .05.*、**、*** 和 **** 表示統計顯著性 p 分別為<.05、≤.01、≤.001和≤.0001。
為了確定抗HLA同種抗體的Fc糖基化對補體和/或FcγR介導的血小板吞噬作用的影響，建立了監測人單核細胞來源巨噬細胞吞噬血小板吞噬作用的系統。糖基化譜改變的抗HLA單克隆抗體（mAb）（補充圖S1A-C）如下所述[報價單46,報價單47]并進行基于液相色譜-質譜的IgG Fc糖基化分析，以確認預期的糖基化曲線（補充圖S1D）。
將血小板與未修飾和糖工程化的抗HLA hIgG1 mAb（SN230G6、SN607D8和W6/32）在補體充足血清存在下孵育，從而實現抗體和補體調理。只有SN230G6和SN607D8抗體的組合導致強烈的C3b沉積，盡管泛HLA I類識別W6/32（補充圖S1B）自行引起補體沉積（補充圖S1E），與我們之前的觀察結果一致[報價單47].半乳糖基化和唾液酸化升高的抗體顯著增強了補體沉積。mAb的巖藻糖基化對補體沉積沒有影響（補充圖S1E）。PG LALA Fc突變體，不能結合C1q和FcγR[報價單53]，也沒有熱滅活血清（HI血清）導致C3b沉積（補充圖S1F）。通過SPR陣列評估了這些糖工程抗體與人FcγR的結合，證實了FcγRIIIa/b的親和力增加，而FcγRIIa/b的親和力差異沒有觀察到（補充圖S2）。
調理的PKH26標記的血小板與單核細胞來源的M1樣巨噬細胞（圖 1A).這些分化的巨噬細胞表達所有類別的FcγR（FcγRI（CD64），FcγRII（CD32），FcγRIII（CD16））以及CR3（CD11b / CD18）（圖1B），所有參與吞噬作用的關鍵受體[報價單8,報價單11,報價單36,報價單37,報價單59].使用成像和常規流式細胞術測定血小板的內化（門控策略分別在補充圖S3A和3B中描述）。血小板特異性標志物CD42a用于檢測巨噬細胞外部的血小板（圖1C).大多數血小板陽性（PKH+）巨噬細胞是CD42a-。此外，使用成像流式細胞術顯示，大多數PKH+ CD42a +事件由同時具有吞噬作用（PKH + CD42a-）和結合（PKH+ CD42a +）血小板的巨噬細胞組成，表明總PKH+區室與血小板吞噬的定量相關（圖 1D-E 和補充圖S3A，下面板）。因此，通過常規流式細胞術分析PKH+巨噬細胞的總區室以評估血小板吞噬作用，因為排除PKH + CD42a +事件會導致吞噬效率的低估。
圖1. A) 監測調理化血小板吞噬作用的實驗裝置的示意圖概述：用GM-CSF將CD14 +單核細胞培養9天，以分化為單核細胞來源的巨噬細胞（MQ M1）。此后，巨噬細胞在有和沒有FcγR阻斷劑的情況下預先孵育。來自HLA-A2+供體的新鮮分離的血小板用PKH26標記，并在補體充足或熱滅活（HI）血清存在下與未修飾和糖工程化的抗HLA單克隆抗體預孵育，用于抗體和補體調理。將巨噬細胞和血小板洗滌并在37°C下共孵育30分鐘，并通過流式細胞術和Imagestream進行分析 B) 通過流式細胞術分析的單核細胞來源巨噬細胞表面補體受體3（Cd11b / cd18）和FcγR（FcγRI，FcγRII，FcγRIII）的表達水平。 C-E） 血小板的內化是用 C) 常規和 D-E） 成像流式細胞術。抗CD42a-BV421染色與PKH26聯合用于鑒定附著在細胞外部的血小板。顯示了通過成像流式細胞術獲得的指示象限的代表性圖像。
與未調理的血小板（圖 2A，B).以抗體濃度依賴性方式觀察吞噬作用，吞噬細胞MQ的最大百分比為1μg/mL。盡管半乳糖基化和唾液酸化水平升高的糖工程mAb顯著增強了血小板上的補體沉積（補充圖S1E），但這些并沒有導致更高水平的后續吞噬作用（圖2C).此外，用非糖基化IgG調理，這增加了對FcγRIII的親和力（[報價單21]和補充圖S2），與未修飾的抗體（圖2C).此外，將血小板與單獨的未修飾抗HLA單克隆抗體SN230G6或SN607D8孵育可增強吞噬作用（補充圖S4A-B），并且不受抗體Fc聚糖修飾的影響（補充圖S4C-D）。與SN230G6 + SN607D8組合類似，與未調理的血小板相比，將血小板與泛HLA I類抗體W6/32孵育導致吞噬作用顯著增加（圖 2D，E).以抗體濃度依賴性方式觀察吞噬作用，不受任何抗體聚糖修飾（圖 2E，F).這些結果表明，觀察到的吞噬作用主要不是通過補體受體或FcγRIIIa/b介導的。
圖2. 單核細胞來源的巨噬細胞吞噬補體和抗體調理血小板 A） 絕對和 B) 在補體充足血清存在下，與不同濃度的未修飾的hIgg1抗HLA單克隆抗體（mAb）SN230G6 + SN607D8一起孵育的血小板吞噬相對水平 C) 在補體充足血清存在下，用未修飾和糖工程的hIgg1 SN230G6 + SN607D8 mAb預孵育的血小板之間的吞噬作用差異。 D) 絕對和 E) 在補體充足血清存在下，與不同濃度的未修飾的泛抗 HLA I 類 hIgg1 mAb W6/32 預孵育的血小板吞噬相對水平 F) 在補體充足血清存在下，用未修飾和糖工程hIgg1 W6 / 32 mAb預孵育的血小板之間的吞噬作用差異。 G-H） 在補體充足或熱滅活 （HI） 血清存在下，用 1 μg/ml 未修飾或 PG LA LA Fc 突變抗 HLA mAb（SN230G6+SN607D8 或 W6/32）預孵育的血小板的相對吞噬水平 A-H） 吞噬作用水平（%）定義為PKH26+巨噬細胞部分（Q1 + Q2）的百分比。數據表示在2-4個獨立實驗中使用的2-5個不同單核細胞供體的2個技術重復的平均值和SD，對于每個獨立實驗，還使用了不同的血小板供體。數據點的顏色表示不同的單核細胞供體。對于標準化，如圖所示，用1μg/ ml未修飾的抗HLAmAb孵育的血小板的吞噬作用水平設置為1。采用Dunnet多重比較檢驗的普通單因素方差分析進行統計分析。*p ≤ .05， ****p ≤ .0001 和 ns = 不顯著 .
與此一致，用HI血清調理的血小板不會導致巨噬細胞吞噬作用減弱（圖2G).然而，用PG LA LA Fc突變體進行血小板調理作用顯著消除了吞噬作用（圖2G），提示吞噬作用依賴于 FcγR，但與補體無關。在W6/32中觀察到相同的趨勢，其吞噬作用似乎不受HI血清（圖2H).然而，必須注意的是，在補體充足血清存在的情況下，將血小板與未修飾的W6/32抗體孵育僅會導致低C3b沉積（補充圖S1E）。
為了初步評估哪種FcγR可能參與抗HLA調理血小板的吞噬作用，使用了FcγR阻斷抗體。雖然阻斷FcγRII或FcγRIII導致吞噬作用的減少可以忽略不計，但單獨阻斷FcγRI或與FcγRII和FcγRIII聯合阻斷，導致單核細胞衍生巨噬細胞對調理血小板的吞噬作用降低（補充圖S4E-F）。我們假設在阻斷FcγRI時，對于用低巖藻糖化抗體調理的血小板，對FcγRIII的親和力增加可能會變得明顯。引人注目的是，FcγRI阻斷抗體的存在似乎不會影響低巖藻糖基化W6/32抗體的吞噬作用（補充圖S4G）。
Ancell抗人Fc受體抗體，Fab，F（ab'）2，偶聯物
抗CD16 （FcgRIII）
抗CD32 （FcgRII）
抗CD64 （FcgRI）
Ancell 著名的專注做人種屬的流試抗體提供商。
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